Innehåll
Elektrofores tekniker separerar DNA-molekyler baserat på deras storlekar; liknande tekniker för proteiner kan separera dem baserat på storlek eller laddning. I båda fallen framställs gelén genom vilken molekylerna migreras med användning av en buffertlösning, en kemikalie som verkar för att stabilisera pH. Kepsen uppfyller flera viktiga roller i elektrofores.
ström
Elektroforesgelen arbetar genom att applicera en elektrisk ström till den nedsänkta gelplattan i bufferten. DNA-molekylerna är negativt laddade, och proteinerna kan negativt laddas genom att denaturera dem först och sedan behandla dem med natriumdodecylsulfat (SDS). Proteiner eller DNA-molekyler migrerar från den negativt laddade katoden till den positivt laddade anoden. Vatten är dock ett ganska dåligt fordon i nuvarande - det bär bara ström effektivt när det löser upp ämnen i det, eftersom laddade joner rör sig i ett elektriskt fält. Buffertlösningen har en högre koncentration av joner (högre jonstyrka), så det kan bära mycket mer ström än rent vatten.
PH förändring
PH mäter koncentrationen av vätejonen. Förändringen i pH kan förändra nettoladdningen av molekyler, såsom protein eller DNA, vilket orsakar en långsammare (eller snabbare) migrering. Det beror på att dessa molekyler har grundläggande delar som accepterar vätejoner (protoner) och många sura delar som kan donera protoner. När en syra donerar en proton blir den negativt laddad; när en bas accepterar en proton, tvärtom blir den positivt laddad. När koncentrationen av vätejoner i lösningen ökar blir proteiner och DNA mindre negativt laddade (eller mer positivt laddade). Det pH, vid vilket en molekyl, som protein, inte laddas, kallas en isoelektrisk punkt. Buffertar stabiliserar pH i gelén vid en nivå där DNA: n kommer att laddas negativt och kommer att migrera som önskat.
Stapelgel
Buffertar spelar en ännu mer komplex roll i en sorts elektrofores som kallas SDS-PAGE eller natriumdodecylsulfat, polyakrylamidgelelektrofores. Detta är en av de vanligaste teknikerna för proteinanalys. De denatureras genom värmebehandling och beläggs sedan med natriumdodecylsulfat och tillsätts sedan endast till gelén, som i allmänhet löper vertikalt. Gelén har två regioner, den stackande (i den överlägsna delen) och den ena av att springa under. Staplingsgelén framställs med en annan buffert så att dess pH är lägre än för löpgelén, dessutom har den en mindre jonstyrka. Dessa två faktorer orsakar stapling av proteinet, så det går allt i löpgelén samtidigt. Denna effekt hjälper till att separera proteinerna i gelén enligt deras storlek.
Cap DNA elektrofores
De två vanligaste buffertarna för DNA-gelelektrofores är tris-acetat EDTA och tris-borat EDTA, där EDTA står för etylendiamintetraättiksyra. Det är viktigt eftersom det tjänar som en chelator för magnesiumjoner, avlägsnar dem från lösningen. Dessa joner är nödvändiga kofaktorer för enzymer som kallas DNA som bryter DNA, så EDTA i bufferten fungerar som en extra försiktighet för att förhindra eventuella problem med DNA.