Innehåll
- Detektion med färgändringar
- Använda en ELISA-läsare för mätning
- Direkt konkurrenskraftig ELISA (cytokrom c)
- Inkubera den primära antikroppen i rör
ELISA-testet är en enzymbunden immunosorbentanalys som använder antikroppar eller antigener kopplade till ett specifikt enzym för att bestämma koncentrationen av antikropp eller antigen. Om du tar en ELISA och inte kan använda specifika antikroppar för att erhålla dina resultat, föreslås konkurrenskraftig ELISA eftersom den använder ett antigen som är konjugerat till ett enzym istället för antikroppen och en annan detekteringsmetod.
Detektion med färgändringar
Ett gemensamt protokoll för konkurrens ELISA är att använda en omärkt och renad primär antikropp. Antikroppen täcker brunnarna i en mikrotiterplatta och inkuberas med okända standarder. En immunogen tillsättes sedan till konjugat med den primära antikroppen, som kommer att binda till antikroppsställena som ännu inte är upptagna. Ett substrat används sedan för att skapa en färgförändring för mätning av bindningskoncentration.
Använda en ELISA-läsare för mätning
Använd en mikrotiterpolystyrenplatta och sätt den primära antikroppen till varje brunn. För att uppnå maximal bindning, fyll i brunnen med ett mikrogram av antikroppen. Inkubera plattan i fyra timmar vid rumstemperatur. Tillsätt den primära infångningsantikroppen och tvätta brunnarna med PBS (fosfatbuffrad saltlösning). Inkubera plattor med blockerande buffert i två timmar vid rumstemperatur. Tvätta brunnarna två gånger igen med PBS och lägg till standarderna. Placera antigen-konjugatlösningen i brunnarna och inkubera igen i två timmar. Tvätta plattan igen med PBS fyra gånger. Lägg substratet och mäta densiteterna vid den specifika våglängden med hjälp av en ELISA-läsare.
Direkt konkurrenskraftig ELISA (cytokrom c)
För en direkt konkurrenskraftig ELISA måste en serumutspädningsanalys för antigenet du använder i experimentet utföras. Mikrotiterplattan belägges därefter med cytokrom c och inkuberas över natten. ELISA-delen av analysen utförs sedan genom tillsats av blockerande reagens och sekundär antikropp. Absorbansresultat läses med en mikroplattläsare.
Inkubera den primära antikroppen i rör
Vid denna procedur inkuberas den primära antikroppen i provrör i vilka antigenet av intresse binder till det. Proven tillsättes sedan till brunnarna i mikrotiterplattorna och inkuberas. Brunnarna tvättas sedan för att avlägsna eventuella obundna antigen-antikroppskomplex, och sedan tillsättes blockeringslösningen för att förhindra att den andra antikroppen binder till brunnarna. Den sekundära antikroppen läses sedan på en plattläsare för att erhålla resultaten.